Городская больница

Справочник заболеваний и лекарств

Иммунохимический анализ крови

Иммунохимический анализ (ИХА) – это комплексная методика, которая определяет популяцию клеток, концентрацию сывороточных иммуноглобулинов, циркулирующие иммунные комплексы, параметры лейкоцитов, принимающих участие в фагоцитозе. Его назначают только в крайних случаях, поскольку он дорогостоящий. Но в то же время, результаты этого анализа дают врачу точную картину для понимания возможности организма противостоять различным заболеваниям.

Значение и преимущества анализа

В этот анализ входит проверка количества иммуноглобулинов и репродуктивных гормонов. Гормональная и иммуноферментная диагностика дает возможность понять общее состояние человеческого организма, качество его защитной и репродуктивной функции.

Данный диагностический метод – довольно дорогое удовольствие, но его результаты того стоят. При его помощи специалист может поставить окончательный диагноз даже в самых сложных случаях. Например, благодаря иммуноферментному анализу врач может определить соотношение «антиген-антитело», то есть увидеть количество антител, реагирующих на различные раздражители. Сегодня ИФА считается самым информативным при диагностировании недугов инфекционного характера.

Помимо высокой результативности, ИХА имеет еще одно неоспоримое преимущество – доступность. Практически каждая медицинская лаборатория предоставляет такую услугу. Комплексный анализ назначается в очень редких случаях, поскольку большинству пациентов требуется проверить один или несколько показателей.

С помощью этого анализа определяется:

  • Анемия.
  • Онкологические патологии.
  • Гормональные нарушения.
  • Бесплодие.
  • Инфекционные и вирусные заболевания.
  • Сахарный диабет.

Показатели ИХА

Данный анализ считается комплексным иммунологическим исследованием и состоит из таких показателей:

  • IgA. Это вещество регулирует защитную функцию слизистой оболочки бронхов, почек, мочевого пузыря, легких, желудочно-кишечного тракта. При обострении патологий его еще сложно определить, самый ранний срок обнаружения – 14-17 дней после развития инфекции. При диагностике на позднем сроке может показать хронический характер заболевания.
  • IgE. Определяет аллергические и паразитарные процессы. К сожалению, он реагирует не на все возбудители, поэтому пациенту может потребоваться дополнительные обследования.
  • IgM. Показатель обострения Нарушение нормы фиксируется уже на пятый день после попадания раздражителя в человеческое тело. Повышенный показатель IgM понижается к допустимому на протяжении 35 дней.
  • IgG. Остаточный иммуноглобулин, фиксирует образование иммунитета к какому-то заболеванию или патологии. Проявляется в сыворотке уже через 26-29 дней после возникновения недуга. Он может фиксироваться в плазме несколько лет или даже всю жизнь, при этом его показатель не считается симптомом развития болезни.
  • IgD. Его невысокий показатель считается нормой для всех людей. Повышение или снижение этой нормы расценивается как признак физиологического и иммунодефицитного сбоя.
  • Лютеотропин. Гипофизный гормон, необходимый для правильного функционирования половых желез. Это вещество очень важно для нашего организма, поскольку обеспечивает выработку тестостерона, эстрогена и прогестерона. В женском организме лютеотропин обеспечивает менструальный цикл.
  • Пролактин. Характерный гормон лактационного периода, активизируется во время вынашивания плода. Если показатель увеличивается не из-за беременности, он будет препятствовать продуцированию других гормонов.
  • Эстрадиол. В женской половой системе считается самым активным веществом. Благодаря ему в женщины развиваются вторичные половые признаки, менструация, созревает яйцеклетка.

Показания к проведению анализа

Это исследование не является профилактической мерой. Его принято назначать при таких показаниях:

  1. Генетическая склонность к иммунным патологиям. Анализ позволяет выявить малейшие сбои в функциональности иммунитета. Такие нарушения в скором времени провоцируют развитие иммунодефицита, истинную причину которого определить очень трудно. Нередко иммунные заболевания имеют генетическую предрасположенность и внезапно проявляются в любом возрасте.
  2. Подозрение на онкологические патологии. Анализ охватывает и онкомаркеры. Он показывает не только присутствие злокачественных клеток, но и показывает процентную предрасположенность пациента к образованию опухолей.
  3. Проблемы с зачатием. Семейные пары, которые испытывают трудности в зачатии ребенка на протяжении длительного времени, могут пройти анализ на половые гормоны, чтобы определить причину и степень совместимости с партнером.
  4. Недуги аутоиммунного характера. Они возникают в результате нарушения нормальной работы иммунитета, который выступает по отношению к собственному организму агрессором, а не защитником.

Подготовка к анализу, его проведение

Забор крови для иммунохимического анализа не отличается от биохимического анализа. Лаборант берет у пациента венозную кровь. Далее сыворотка анализируется специальным лабораторным устройством. Благодаря техническому прогрессу результат анализа можно получить уже через полчаса после забора крови, но в нашей стране большинство лабораторных учреждений выдают его через 2-3 дня после процедуры.

Подготовительные меры не отличаются сложностью и длительностью. Для получения максимально точного результата пациент должен:

  1. Не есть за 12 часов до забора крови.
  2. Проходить процедуру на пустой желудок.
  3. Сдавать кровь до 11 часов дня.

Разрешается выпить перед процедурой 200-250 мл чистой воды.

Хотя этот анализ не включает в себя печеночные пробы и показатель ТТГ, специалисты рекомендуют за 3-4 дня до анализа исключить из ежедневного рациона жирные блюда и пищу, обогащенную белком. Данный запрет связан с тем, что эти вещества делают кровь более вязкой, из-за чего сыворотка мутнеет и усложняет обследование.

Важно! За пять дней до забора крови пациенту запрещается принимать алкоголь в любом виде. Это вещество негативно влияет на гормоны и показатели крови.

Нежелательно курить за 24 часа до анализа. Как показывает статистика, лишь 8 процентов пациентов придерживаются этой рекомендации. Из-за этого врачи просят не принимать никотин хотя бы в то утро, когда будет проходить процедура.

Женщинам-пациенткам нужно обязательно предупредить своего лечащего врача о фазе месячного цикла. День, когда будет происходить забор крови, сильно влияет на концентрацию половых гормонов, поскольку этот показатель связан с менструальным циклом. Если анализ проходит будущая мамочка, врач должен учитывать срок вынашивания ребенка.

Один из важнейших подготовительных аспектов – прием медикаментозных средств. В идеале пациент обязан прекратить пить лекарства за неделю-полторы до анализа, но если это невозможно, то врач должен учитывать все эти нюансы при расшифровке показателей.

Категорически запрещено сдавать анализ после физических нагрузок или эмоционального стресса, поскольку эти процессы влияют на химический состав крови. Перед тем как зайти к лаборанту, пациент должен посидеть спокойно хотя бы 25 минут.

Иммунохимический анализ каловых масс

Проверка скрытой крови необходима для диагностирования рака прямой кишки или эрозивных повреждений слизистой кишечника. С его помощью у врача появляется возможность диагностировать полипы и рак, которые проявляются только кровотечениями. Благодаря этому анализу пациенты могут пройти полную диагностику кишечника и установить концентрацию гемоглобина в кале. Подготовка к данному исследованию стандартная.

Экспресс-тест для анализа кала на количество гемоглобина состоит из:

  • Индикаторного планшета.
  • Аппликатора.
  • Реагента.
  • Инструктивного письма.

Данное исследование базируется на результате взаимодействий специфических антител с гемоглобином, что приводит к образованию соединений антиген-антитело. Розовая и фиолетовая линии на бланке теста показывают уровень гемоглобина и фиксируют нарушение его допустимых показаний.

: Иммуноглобулин Е – норма у детей и отклонения

ИХА на наличие хламидий

Данное исследование помогает подтвердить или опровергнуть присутствие внутриклеточных паразитов в теле пациента. Параллельно с этим оно дает информацию о примерном времени заражения и возможных осложнениях для здоровья исследуемого. Этот анализ требует подбора специфических антигенов, материалом выступает сыворотка или плазма. Для расшифровки и определения диагноза применяют иммуноглобулины.

Благодаря этому методу врач может выявить заражение на самых ранних его этапах и точно узнать особенности антител. ИХА требует специальной подготовки, поэтому пациент обязан придерживаться всех рекомендаций, которые получил у врача.

Поскольку иммунохимическое исследование показывает стадию инфекционного поражения, врачу проще подобрать необходимую терапию.

ИХА мочи

Данная диагностика количественного показателя уропротеина дает возможность проверить качество и концентрацию белкового показателя мочи, что особенно важно при подозрениях на пиелонефрит и гломерулонефрит.

Расшифровка иммунохемилюминесцентного анализа

Расшифровывать данные исследования должен только врач. Эта процедура достаточно сложная и требует от специалиста большого объема знаний и опыта.

Важно! Для постановки диагноза врач сравнивает показатели иммунохимического анализа, собранного анамнеза и других проведенных исследований.

Ученые разработали специальную таблицу, где собраны допустимые значения основных показателей ИХА и возможные причины отклонений от нормы.

Показатель Норма Причина отклонения
Иммуноглобулин А 17 процентов от общего кровяного иммуноглобулина. Превышение нормы может быть признаком красной волчанки, печеночных и почечных недугов. Понижение нормы диагностируют при циррозе и отравлении.
Иммуноглобулин Е 0,2 процента от общего кровяного иммуноглобулина. Фиксируется только повышенный уровень, если пациент заражен гельминтами. К провокаторам относят аллергические реакции (экзему, жжение и покраснение эпителия, отечность).
Иммуноглобулин М 5-5,2 процента от общего количества вещества. Превышают допустимый показатель кандидозы, печеночные патологии, волчанка, острые инфекции.
Пролактин У мужского пола – 103 – 535 мМЕ/л, у женского – 59 – 699 мМе/л. Превышение нормы провоцирует туберкулез, новообразования в гипофизе, прием фармацевтических средств. У женщин повышается при кормлении грудью, но это не является нарушением.
Лютеотропин Мужской показатель – 1,15 – 8,9 мЕд/л. У женщин норма тесно связана с менструальным циклом. Понижение нормы провоцируют опухолевые поражения гипофиза, ожирение, аменорея. Повышает показатель поликистоз яичников, почечная недостаточность, эндометриоз, длительный дефицит пищи.

Расшифровка анализа взрослого пациента должна выполняться с учетом его индивидуальных особенностей, генетической склонности к заболеваниям, общего состояния на момент сдачи анализа и правильности подготовительного этапа к процедуре.

Как показывает практика, в современной медицине иммунохимический анализ по праву считается одним из самых эффективных диагностических приемов.

Расшифровка иммунохимического исследования крови

Иммунохимическое исследование крови является совокупным обследовательским мероприятием. Этот способ диагностики поможет узнать то, насколько защищен человеческий организм от разных инфекций и отрицательных факторов внешнего воздействия. Если сбои в иммунной системе будут до того, как человек родился, значит дефицит иммунитета будет врожденного характера, а если после, тогда такое состояние будет приобретенным.

Для оценки иммунного статуса человека выполняют это исследование. Оно необходимо для того, чтобы установить:

  • клеточные популяции;
  • число иммуноглобулиновых компонентов сыворотки крови;
  • циркулирующие комплексы антиген-антитело;
  • значения лейкоцитарных клеток (фагоцитов), принимающих участие в поглощении крупных макромолекулярных комплексов или корпускул, бактериальных микроорганизмов.

Для того, чтобы провести иммунохимический анализ крови, надо чтобы были собраны следующие данные:

  • пропорция между клиникой и изменением иммунного статуса;
  • разница существующих параметров от нормальных;
  • информация о начальных проявлениях патологического процесса;
  • данные о лечебных мерах и объеме применяемых лекарственных средств.

Главные способы данного исследования

При выполнении иммунохимического исследования крови главное значение принадлежит циркулирующим иммунным комплексам (антиген воздействует на антитело). Исследования применяются для того, чтобы установить:

  • первопричину инфекционного процесса паразитарного генеза;
  • количественный показатель гормональных соединений в то время, когда женщина беременна;
  • наличие маркеров;
  • группу крови.

Иммунохимия позволяет выявить разведение сыворотки, где обнаруживаются антитела (титр антител) к патогенным микроорганизмам, изучить особенности иммунитета человека. Антигенные соединения обнаруживают благодаря сывороткам крови, в которых содержатся белковые соединения плазмы крови, препятствующие размножению возбудителей и подавляющие выделяемые ими токсические соединения (антитела). Иммунологические исследования помогут выявить антитела к предварительно определяемому антигену.

Для анализа берется кровяной биоматериал у пациента на протяжении первых суток патологического процесса. Постановка диагноза осуществляется после проведенного второго исследования спустя две недели.

Иммунохимическое исследование часто показано при состояниях, если:

  • Подозреваются дефекты иммунной системы, вызванные отягощенной наследственностью.
  • Подозревается онкологическая патология.
  • Женщина не может долго зачать ребенка.
  • Существуют аутоиммунные патологические процессы.

О параметрах исследования на иммунохимию

Так как иммунохимическое исследование является совокупностью тестовых анализов, перечень составляющих его параметров разнообразен. Часто выполняют иммуноферментное и гормональное исследования, поэтому параметрами считаются половые гормональные соединения и разные иммуноглобулиновые классы. Исследуются иммуноглобулины (Ig):

  • А — ответственен за свойства защиты слизистых легочной, бронхиальных, почечных, мочеточниковых, мочепузырных тканей, включая слизистые тканевые структуры пищеварительного тракта. В остро протекающей фазе этот иммуноглобулин не выявляется. Он проявляется с начала второй недели инфекционного процесса. В позднем временном промежутке он укажет на хронизацию патологического процесса.
  • Е — определяет то, как реагирует организм на аллергены и инфекционные процессы, причиной которых являются паразиты. Но при определенных инфекционных процессах и типах аллергических реакций показатель данного иммуноглобулина остается неизменным. Для этого необходимы дополнительные исследования.
  • М — иммуноглобулиновый элемент остро протекающего срока патологического процесса. Этот иммуноглобулин возникает в кровяной среде первым на пятые сутки после внедрения инфекционного агента в человеческий организм. Находится в крови примерно 1,5 месяца, потом пропадает.
  • G — остаточный иммуноглобулин, показывает присутствие резистентности к какому-либо патологическому процессу. В кровяной среде проявляется где-то через 30 суток после того, как начался патологический процесс. Остается в крови долгие годы или на всю оставшуюся жизнь, но об присутствии патологического процесса не сообщает.
  • D — в минимальном объеме имеется у каждого человека. Способен показать, как дефицитное состояние иммунитета, так и нормальное состояние организма.

Также исследуются гормоны:

  • Лютеинизирующее гипофизарное гормональное соединение. Ответственно за функцию половой системы. От его синтеза существует зависимость концентрации иных половых гормональных соединений (прогестеронового, эстрогенного, тестостеронового). У женского пола данный гормон отвечает за месячный цикл.
  • Пролактиновое гормональное соединение. Отвечает за процесс, при котором происходит секреция молока у родившей женщины. В огромных объемах вызывает торможение синтеза половых гормонов.
  • Эстрадиоловое гормональное соединение. Существует у женщин, ответственно за то, как созревают яйцеклетки, выражаются вторично проявленные половые признаки, происходит месячный цикл.

О самом исследовании и подготовке

Забирают кровяной биоматериал на иммунохимию стандартно. У больного берут кровь из венозного сосуда. Она исследуется особым анализаторным устройством. Поэтому данные анализа будут готовы спустя 12-22 минуты.

Многие лаборатории дают такую информацию в срок от 1 до 2 суток после того, как больной сдал кровь. Для достоверности результатов требуется соблюдение некоторых условий.

Кровяной биоматериал надо сдавать в утреннее время натощак.

Утром допустимо утолить жажду простой водой, но не следует принимать пищу. Последняя трапеза должна быть не позднее 10 часов в вечернее время перед исследованием. Также рекомендовано воздержание от продуктов, обильно богатых жирами и белками.

Эти соединения увеличивают кровяную сворачиваемость, сыворотка становится помутненной, а это помешает исследованию биоматериала. Перед данным исследованием за 2-3 суток не следует пить алкоголь, иначе исследование будет недостоверным. Также противопоказано курение хотя бы за 2-3 часа до исследования.

Женщина обязана уведомить доктора о периоде месячного цикла. От этого периода зависит концентрация половых гормональных соединений, которые изменяются согласно времени цикла. Если женщина беременна, то учитывают срок и триместровый период.

Перед тем, как выполнять исследование, отменяют лекарства. Если доктором отмена не рекомендована, то проведенная расшифровка должна учитывать тип и дозу лекарственного средства и то, как оно влияет на разные параметры. Не сдают анализ после того, как человек физически трудился, испытал стрессовые ситуации.

Перед исследованием надо присесть минут на 7-11, быть в спокойном состоянии и только потом сдавать кровь.

О расшифрованных данных

Данные иммунологического исследования расшифровывает лечащий доктор. Само исследование нельзя назвать простым, оно содержит разные особенности. Самостоятельная расшифровка исследования не рекомендована.

Важно знать, что для того, чтобы установить диагноз, учитывают данные выполненного исследования, анамнез больного, а также другие обстоятельства.

Расшифровываются данные следующим образом:

  • Имуноглобулиновый компонент А. Нормальный параметр его состоит в пределах 15% от общего числа антител (иммуноглобулинов) в крови. Если параметр высокий, то у больного красная волчанка, печеночная, почечная, соединительнотканная патологии. Низкий уровень наблюдается при циррозных процессах и интоксикациях.
  • Иммуноглобулиновый компонент Е. Высокая концентрация данного иммуноглобулина говорит о паразитарной инвазии или атопических реакциях при аллергии (отечные явления, насморк, высыпания, кожный зуд).
  • Иммуноглобулиновый компонент М. Его показатель содержит не более 5% всего объема антител. Концентрация повышена при инфекционных процессах разных причин в остро протекающей фазе, молочнице, тяжелых повреждениях печени, системной красной волчанке.
  • Пролактиновый гормон. У мужского пола нормальный показатель более четкий, чем у женского, поскольку у женщины норма связана с месячным циклом. У мужчины норма от 105-110 до 530-540 мМЕ/л. У женщины от 65-70 до 720-725 мМЕ/л. При нормальных условиях у женщины концентрация увеличивается во время лактации. Еще на пролактиновую концентрацию оказывают влияние некоторые лекарства и патологические процессы (туберкулез, поликистозные изменения яичников, гипофизарные злокачественные новообразования).
  • Лютеинизирующий гормон. Его концентрация изменяется согласно месячного цикла у женщины, а у мужчины составляет 1,14-9 мЕд/л. Низкая концентрация бывает при онкологии гипофиза, избыточной массе тела, отсутствии менструации. Высокая — при поликистозных изменениях яичников, недостаточности почек, разрастании эндометрия, а также при состоянии, если человек долго голодает.

При расшифровывании данных большую важность представляет отягощенная наследственность, состояние больного (месячный цикл, беременность, хронические патологические процессы), а также вероятные погрешности и случаи, при которых больной неправильно подготовился.

Данное исследование представляет огромную важность для диагностики тяжело протекающих инфекционных процессов, аутоиммунной патологии, интоксикационных состояний, разных видов аллергий, проблем с репродукцией. Поэтому больной обязан соблюдать все рекомендации доктора при проведении данного анализа, что позволит точно определить патологический процесс и эффективно с ним бороться.

Лекция 13. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

•Молекулярные основы иммунохимического анализа. Специфичность и чувствительность

иммунохимических (серологических) реакций. Уровни регистрации реакций антиген-антитело

(первичный и вторичный).

• Феномен агглютинации. Прямая и непрямая агглютинация. Эритроциты как один из носителей

антигенов в реакциях непрямой агглютинации.

• Феномен преципитации и основанные на нем реакции. Диффузионный метод преципитации и

иммуноэлектрофорез.

• Реакция связывания комплемента. Компоненты, необходимые для постановки реакции. Характеристика

индикаторной системы для суждения об активности комплемента.

• Нейтрализация и усиление биологических эффектов антигена.

• Принцип реакций, основанных на меченых антителах. Варианты меток. Иммунофлюоресцентный и

иммуноферментный анализы. Иммуноблоттинг.

• Значение иммунохимического анализа в биологии и медицине.

Иммунохимический анализ объединяет методы, основанные на реакциях антиген-антитело. Такие реакции часто называют «серологическими», так как до недавних пор единственным источником антител служила сыворотка (лат. serum) крови иммуннизированных животных. Лишь с внедрением гибридомной технологии антитела стали получать в культурах клеток. Это существенно повысило специфичность анализа, так как каждая гибридома продуцирует антитела против единственного эпитопа.

С помощью иммунохимического анализа решаются две основных задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют известные антитела. Например, выявление поверхностного антигена вируса гепатита В проводят при помощи антител против HВsAg, а наличие анти-HВs антител тестируют в реакциях с HвsAg.

Главным стимулом для совершенствования иммунохимических методов было (и остается) стремление к повышению их чувствительности: она тем выше, чем меньше концентрация выявляемых антител и антигенов. Другим мотивом служило изучение антигенных смесей, нацеленное на расшифровку входящих в их состав компонентов. Сюда примыкает анализ спектра антител, продуцируемых в ходе иммунного ответа, например инфекционного процесса1.

Взаимодействие антиген-антитело исследуют на двух уровнях – первичном и вторичном. В первом случае констатируют лишь сам факт образования иммунного комплекса. Это можно сделать, если антиген или антитело мечены подходящим маркером, например, изотопом. Такие анализы отличаются максимальной чувствительностью. Вторичный уровень характеризуется внешними (видимыми) проявлениями реакции. Они требуют для своего воспроизведения более высокой концентрации ингредиентов (антигенов и антител), т.е. менее чувствительны.

Методы, основанные на вторичных (внешних) проявлениях реакции антиген-

антитело (реакции второго уровня)

Внешние (вторичные) эффекты, на которых базируется иммунохимический анализ, включают (1) агглютинацию, (2) преципитацию, (3) связывание комплемента, (4) нейтрализацию или усиление биологических эффектов антигенов.

Агглютинация (от лат. agglutinare – склеивать).Один из ингредиентов реакции (обычно антиген) находится в корпускулярной форме. Антитела выявляются по их способности агглютинировать антигенные частицы, например, бактерии, эритроциты, латекс и пр.

Антиген может быть собственным компонентом частицы либо искусственно сорбирован на ней. В первом случае говорят о прямой агглютинации, второй вариант называется непрямой, или пассивной агглютинацией. Чувствительность пассивной агглютинации выше, так как плотность антигенных молекул на частицах в этом случае больше, чем на естественных носителях. Одним из распространенных адсорбентов служат эритроциты – реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Преципитация(от лат. precipitare – осаждать).Оба ингредиента находятся в растворимой форме. При их взаимодействии (в определенных концентрациях и соотношениях) образуется осадок. Наиболее широко используется двойная (или встречная) иммунодиффузия в геле (агар, агароза). В этом случае антиген и антитело мигрируют навстречу друг другу, и каждая пара образует собственную линию преципитации. Исследуя количество и взаиморасположение линий, можно судить о числе ингредиентов реакции и степени их идентичности (рис. 1-13).

Рис. 1-13. Двойная иммунодиффузия в геле (реакция по Оухтерлони).Анализ фракций сыворотки человека, полученных при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-200. Верхние лунки (слева направо) – фракции с мол. массой 19S, 7S и 4S; нижние лунки – цельная сыворотка; центральные лунки антитела против сыворотки человека (антисыворотка кролика). Пересекающиеся линии преципитации (верхний ряд) означают, что фракции содержат разные антигены. Сливающиеся линии нижнего ряда говорят об идентичности антигенов, внесенных в его лунки (цельная сыворотка).

Разрешающую способность метода можно существенно повысить, если смесь антигенов предварительно (перед встречной иммунодиффузией) подвергнуть электрофорезу. В этом случае антигены распределяются на большем пространстве, что

повышает дискретность линий преципитации. Эта методика известна как иммуноэлектрофорез (рис. 2-13). Несмотря на низкую чувствительность иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез незаменимы для решения специальных задач.

Связывание комплемента.Реакция основана на том, что комплексы антиген-антитело (IgM и IgG), активируя (связывая) комплемент, снижают его содержание в сыворотке (см. лекция 10). Это происходит даже тогда, когда иммунные комплексы не обнаруживаются визуально, т.е. не образуют агглютинатов или преципитатов. Поэтому РСК отличается высокой чувствительностью.

О потреблении (связывании) комплемента судят по индикаторной системе, которая выявляет цитолитическую активность комплемента. Такой системой служат эритроциты

Рис. 2-13. Иммуноэлектрофорез (классический вариант).Иммуноэлектрофореграммы двух сывороток человека. В лунки геля были внесены сыворотки и проведен электрофорез. Затем в центральную траншею были добавлены антитела против сыворотки человека и проведена реакция встречной иммунодиффузии. По числу линий, каждая из которых соответствует одной паре антиген-антитело, можно судить о количестве компонентов (антигенов) в исследуемом препарате.

барана, покрытые (сенсибилизированные) антиэритроцитарными антителами1, и сыворотка морской свинки (комплемент). Фиксируя комплемент, сенсибилизированные эритроциты (т.е. комплекс антиген-антитело) подвергаются гемолизу. Напротив, если их добавляют в среду, где произошла реакция антиген-антитело, гемолиз отсутствует, так как комплемент истощается «чужими» иммунными комплексами. На этом основании судят о присутствии антител (добавление известного антигена) или антигена (добавление известных антител).

Нейтрализация биологических эффектов антигена.Если антиген обладает биологической активностью, антитела можно выявить по ее подавлению. К такого рода реакциям относится нейтрализация бактериальных токсинов, иммобилизация бактерий, инактивация вирусов и бактериофагов. В диагностической иммунологии широко используется реакция торможения вирусной гемагглютинации. Она основана на способности антител блокировать агглютинацию эритроцитов антигенами (гемагглютининами) вирусов.

Усиление биологических эффектов антигена.Можно привести два примера, когда антитела усиливают (точнее проявляют) биологическую активность антигенов или их носителей. Внутрикожная апликация IgE-антител, содержащихся в сыворотке больных атопическими заболеваниями, предрасполагает к местной аллергической реакции на введение (в то же место) специфического антигена (диагностический тест Прауснитца-Кюстнера). Другой пример – опсонический эффект антител в реакциях с фагоцитами. Здесь антитела после связывания с объектом фагоцитоза (например, бактериями) напрямую или опосредованно (через комплемент) активируют фагоциты (см. лекция 8).

Методы, основанные на меченых антителах (реакции первого уровня)

К этой группе относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализы. Они обладают наиболее высокой чувствительностью, так как не зависят от внешних (вторичных) эффектов, связанных с образованием иммунных комплексов.

Иммунофлюоресцентный (иммунолюминесцентный) анализ. Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, конъюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи специального (люминесцентного) микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин. Поглощая ультрафиолет с длиной волны 290-495 нм, он испускает видимый свет (флюоресцирует) в зеленой части спектра (525 нм). При помощи иммунофлюоресцентного метода была впервые установлена природа клеток, синтезирующих антитела, определена локализация иммунных комплексов при аутоиммунной патологии, разработаны новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний.

Метод используется в двух основных вариантах – прямом и непрямом. В первом случае антитела, конъюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированными на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение, обнаруживаемое под люминесцентным микроскопом (рис. 3-13).

Рис. 3-13. Иммунофлюоресцентный анализ (прямой метод).Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с антителами против искомого антигена, конъгированными с флюоресцеином. После отмывания препарат микроскопируют в ультрафиолете, отмечая флюоресценцию в зонах связывания меченых антител (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Непрямой, или сэндвич-метод может быть использован для определения как антигенов, так и антител. Реакцию проводят в два этапа (рис. 4-13). Сначала антигены, фиксированные на предметном стекле, обрабатывают немечеными антителами. После отмывания связавшиеся с антигеном антитела выявляют при помощи антииммуноглобулиновых антител, меченых флюоресцеином. Это дает возможность пользоваться унифицированным реагентом (меченые антиантитела) для выявления антител к разным антигенам.

Рис. 4-13. Иммунофлюоресцентный анализ (непрямой метод).Исследуемый материал, фиксированный на предметном стекле, инкубируют с немечеными антителами против искомого антигена. После отмывания препарат обрабатывают флюоресцеин-мечеными антителами против антител, использованных на первом этапе (например, козьи антитела против иммуноглобулинов кролика). Отмывают и анализируют под люминесцентным микроскопом (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Радиоиммунный анализ. Меткой служат изотопы, обычно радиоактивный йод. Одним из распространенных вариантов является количественное определение антигенов по конкурентному связыванию с антителами. Принцип основан на ослаблении реакции между антителами и меченым антигеном в присутствии того же, но немеченого антигена. Чем больше антигена в исследуемом образце, тем больше антител будет им заблокировано и тем меньше антител останется для связывания меченого антигена, вносимого в ту же систему. Измеряя радиоактивность иммунных комплексов, можно судить о содержании антигена в исследуемом материале.

Для отделения иммунных комплексов от непрореагировавших ингредиентов предложены разные способы. Самый популярный основан на принципе твердофазных сорбентов. В этом случае антитела фиксируются на инертных частицах, которые легко осаждаются при центрифугировании. Вместе с ними будут оседать и связанные (в том числе меченые) антигены.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Неудобство работы с радиоактивными изотопами побудило к разработке реакций, основанных на антителах и антигенах, конъюгированных с ферментами, чаще с пероксидазой (ее получают из хрена). Присутствие энзиммеченых молекул можно обнаружить визуально или спектрофотометрически по изменению цвета хромогенного субстрата, чувствительному к данному ферменту1. Реакция отличается высокой чувствительностью, так как для ее выявления достаточно ничтожной концентрации фермента (10-15 моль/л и ниже).

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА2. Он основан на том, что один из ингредиентов (антиген или антитело) фиксируется на инертном носителе (обычно полистироле), выполняя роль иммуносорбента. Существуют разные модификации метода. В их основе лежат принципы, о которых уже говорилось в связи с иммунофлюоресцентным и радиоиммунным анализами. На рис. 5-13 и 6-13 прокомментированы два варианта ИФА, широко используемые в диагностике инфекционных заболеваний.

Рис. 5-13. Определение антител в ИФА (непрямой метод). Антигены сорбируют на инертном носителе (лунки полистиролового микропланшета). На первом этапе в лунки добавляют исследуемую сыворотку. Антитела (Ат1) связываются с антигенами. После отмывания в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов человека («античеловеческий иммуноглобу-

лин»), конъгированные с ферментом (второй этап). После отмывания добавляют хромогенный субстрат (например, смесь о-фенилендиамина и перекиси водорода при метке пероксидазой) и каждую лунку спектрофотометрируют относительно негативного (сыворотка без антител) и позитивного (сыворотка с искомыми антителами) контролей (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Рис. 6-13. Определение антигенов в ИФА (принцип «ловушки»). Исследуемый материал (антиген)) вносят в лунки полистиролового микропланшета, где предварительно фиксируют антитела против искомого антигена (первый этап). Антигены связываются с антителами, закрепляясь на сорбенте. После отмывания в лунки добавляют энзиммеченые антитела (Ат-энзим) против того же антигена (второй этап). Они фиксируются на сорбенте за счет связывания со свободными эпитопами антигена. После отмывания определяют активность фермента, закрепившегося на сорбенте (третий этап). Ее величина будет пропорциональна концентрации антигена в исследуемом материале (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992). На втором этапе можно использовать немеченые антитела. Об их связывании с антигеном судят при помощи энзиммеченых антител против имуноглобулинов человека (см. рис. 5-13). Это позволяет унифицировать энзиммеченый реагент, хотя и усложняет реакцию (многослойный сэндвич).

Иммуноблоттинг («Western Blot”). На основе ИФА разработан один из самых специфичных и чувствительных методов иммунохимического анализа – иммуноблоттинг (от англ. blot – промокать, пятно). Он сочетает ИФА с электрофорезом и предназначен для изучения спектра антител к антигенным смесям. Кроме решения научных задач, это имеет важное значение в диагностике некоторых инфекций (таких как гепатит С и СПИД) для исключения ложноположительных результатов «обычного» ИФА (они изредка возникают за счет перекрестно реагирующих («неспецифических») антител).

Рис. 7-13. Иммуноблоттинг.Определение спектра анти-ВИЧ антител. Этап 1: Вирусные антигены (белки (p), гликопротеины (gp)) подвергаются электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Это ведет к разделению антигенов на фракции по молекулярной массе (мол. масса в кДа отмечена цифрами). Этап 2: Фракции антигена переносят при помощи электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на полоски (стрипы). Этап 3: Стрипы инкубируют с исследуемой сывороткой и затем отмывают от несвязавшегося материала. Этап 4: Стрипы инкубируют с энзиммечеными антителами против иммуноглобулинов человека, отмывают. Этап 5: Добавляют хромогенный субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен). Они совпадают с зоной локализации антигенов, которые прореагировали с антителами исследуемой сыворотки. В данном случае сыворотка содержит антитела против gp41, p24 и р31. Это доказывает диагноз ВИЧ-инфекции (E. Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbilogy. 4th ed. J.B. Lippincott Company. 1992).

Принцип метода (на примере выявления антител к вирусу иммунодефицита человека) показан на рис. 7-13. Смесь антигенов, экстрагированных из исследуемого объекта (в данном случае ВИЧ), разделяют на фракции при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и, используя электрофорез, воспроизводят на ней точную копию белковых фракций, полученных в полиакриламидном блоке1. На заключительном этапе полоски (стрипы) нитроцеллюлозы анализируют в реакции ИФА с исследуемой сывороткой. Количество выявленных фракций (пятен) отражает спектр антител к антигенам анализируемой смеси. Наличие антител к двум и более антигенам предполагаемого возбудителя не может быть случайным, подтверждая диагноз заболевания.

В последние годы разрабатываются методы, позволяющие одновременно дифференцировать множество (несколько тысяч) антигенов. Они основаны на использовании наборов (библиотек) рекомбинантных антител, принципиально новых микросорбентов (чипсов, англ. chips) и методов ультраточечной регистрации реакций (лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия, плазмоновый резонанс и др.). Это открывает новые перспективы для функциональной генетики (расшифровка протеома, т.е. всех белков, закодированных в геноме клеток), сравнительного картирования белков нормальных и патологических (в частности, раковых) клеток, изучения фармакологических воздействий и пр.

Тесты для самоконтроля

1. Обязательные ингредиенты иммунохимических (серологических) реакций:

1. Антигены. 2. Комплемент. 3. Цитокины. 4. Антитела. 5. MHC(HLA).

(1,4)

2. Иммунохимические реакции 1-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

(5)

3. Иммунохимические реакции 2-го уровня:

1. Преципитация. 2. Пассивная агглютинация. 3. Прямая агглютинация. 4. Реакция связывания комплемента. 5. Реакции на основе меченых антител. 6. Реакции нейтрализации.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Наверх